① 红细胞的洗涤
洗涤红细胞的目的是去除杂蛋白,采集的血样要及时采用低速短时间离心分离红细胞,然后用胶头吸管吸出上层透明的黄色血浆,将下层暗红色的红细胞液体倒入烧杯,再加入五倍体积的生理盐水,缓慢搅拌10min,低速短时间离心,如此重复洗涤三次,直至上清液中没有黄色,表明红细胞已洗涤干净.
②血红蛋白的释放
在蒸馏水和甲苯作用下,红细胞破裂释放出血红蛋白.
注：加入蒸馏水后红细胞液体积与原血液体积要相同.加入甲苯的目的是溶解细胞膜,有利于血红蛋白的释放和分离.
2．粗分离
①分离血红蛋白溶液
将搅拌好的混合溶液离心后,试管中的溶液分为4层.第一层为无色透明的甲苯层,第2层为白色薄层固体,是脂溶性物质的沉淀层,第3层是红色透明液体,这是血红蛋白的水溶液,第4层是其他杂质的暗红色沉淀物.将试管中的液体用滤纸过滤,除去之溶性沉淀层,于分液漏斗中静置片刻后,分出下层的红色透明液体.
②透析
取1mL的血红蛋白溶液装入透析袋中,将透析袋放入盛有300mL的物质的量的浓度为20mmol/L的磷酸缓冲液中,透析12h.透析可以去除样品中分子量较小的杂质,或用于更换样品的缓冲液.