凝胶层的不连续性：不连续系统的凝胶包括浓缩胶和分离胶.浓缩胶的孔径大,分离胶的孔径小.在电场的作用下,蛋白质颗粒在大孔胶中泳动时遇到的阻力小,移动快.而在小孔胶中泳动时遇到的阻力大,移动慢.因此,在两层凝胶的交界处,由于凝胶孔径的不连续性使样品迁移受阻而压缩成很窄的区带.
缓冲液离子成分和pH的不连续性：在两层凝胶中均有Tris和HCl.Tris的作用是维持溶液的电中性及pH.HCl在一定pH条件下易解离出Cl-,它在电场中迁移率大,走在最前面,故称为快离子或前导离子.电极缓冲液中的甘氨酸在pH8.3的缓冲液中解离度很小,仅为0.1-1%,因而在电场中迁移率很小,称为慢离子或尾随离子.血清中,大多数蛋白质pI在5.0左右,在pH8.3或6.7时均带负电荷,在电场中均移向正极,其有效迁移率介于快慢离子之间,于是蛋白质就在快慢离子间形成的界面处,被浓缩成极窄的区带.当进入pH8.9的分离胶时,甘氨酸解离度增加,其有效迁移率超过蛋白质,因此氯离子和甘氨酸离子沿着离子界面继续前进.蛋白质分子由于分子量大,被留在后面,然后分离成多个区带.
此外,电泳体系中电位梯度的不连续性对样品的浓缩和迁移也具有一定作用.