PCR与DNA复制有何异同?

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  • PCR是DNA的体外扩增技术.

    DNA复制是有生命力的细胞在体内 自我复制的过程 ,属于体内扩增.

    PCR(聚合酶链式反应)原理

    PCR是体外酶促合成特异DNA片段的方法,主要由高温变性、低温退火和适温延伸三个步骤反复的热循环构成:即在高温(95℃)下,待扩增的靶DNA双链受热变性成为两条单链DNA模板;而后在低温(37~55℃)情况下,两条人工合成的寡核苷酸引物与互补的单链DNA模板结合,形成部分双链;在Taq酶的最适温度(72℃)下,以引物3’端为合成的起点,以单核苷酸为原料,沿模板以5’→3’方向延伸,合成DNA新链.这样,每一双链的DNA模板,经过一次解链、退火、延伸三个步骤的热循环后就成了两条双链DNA分子.如此反复进行,每一次循环所产生的DNA均能成为下一次循环的模板,每一次循环都使两条人工合成的引物间的DNA特异区拷贝数扩增一倍,PCR产物得以2n的批数形式迅速扩增,经过25~30个循环后,理论上可使基因扩增109倍以上,实际上一般可达106~107倍.

    DNA复制过程:

    (一)复制的起始

    1.螺旋的松弛与解链

    ⑴拓扑异构酶---能改变DNA空间构像的酶

    作用:DNA复制时松弛超螺旋,以利复制叉的行进及DNA合成,合成后再引向超螺旋.

    功能:不清楚,可催化体外拓扑异构化反应,拓扑异构酶分两型.

    拓扑异构酶I (topoisomerase-- I )

    作用:松弛超螺旋,不需ATP,作用机制:切开环状一条链、打结与解结

    原核:拓扑异构酶I对负超螺旋作用>正超螺旋

    真核:拓扑异构酶I对正、负超螺旋均有作用.

    拓扑异构酶Ⅱ---旋转酶(gyrase)

    作用:松弛超螺旋,作用机制:切开环状两条链、打结与解结、环连与解环连

    ⑵解链酶 (helicase)---复制蛋白rep

    作用:ATP供能时,解开DNA双链.

    原核:编码解链酶的基因是dnaB.前导链结合rep蛋白,随从链结合解链酶II、Ⅲ

    ⑶单链结合蛋白(SSB)

    作用:SSB与解开DNA单链结合,保护稳定DNA.与新复制DNA单链结合,以防其降解.

    螺旋松弛与解链过程如图所示

    2.引发

    ⑴引物酶(primase)

    作用:以DNA为模板,自5'→3'合成RNA小片段约十几到几十个核苷酸,3'末端为-OH.

    原核:dnaG基因编码DnaG蛋白即引物酶.

    ⑵引发前体(preprimosome)

    由多种蛋白因子组成复合物.

    作用:合成RNA引物,沿随从链复制叉的行进方向移动,在不同部位,合成RNA引物.

    小结:合成RNA引物,在引物3'-OH末段进行DNA片段合成.

    二 DNA链的延长

    反应体系:DNA模板,DNA聚合酶,dNTP,引物,Mg2+

    反应式:DNA+dNTP→(DNA)n+1+ppi

    真核与原核中DNA聚合酶(DNA polymorase-DNApol):

    有几种类型,作用方式相同,但各具特性及功能.

    1.大肠杆菌DNA聚合酶(3种)

    ⑴pol I:催化5'→3'的聚合作用,合成20个核苷酸即离开模板,填充空隙.

    3'→5'外切酶活性,去除错误碱基,有校对作用.

    5'→3'外切酶活性,去除RNA引物及修正错误碱基.

    ⑵pol II:催化5'→3' DNA合成并具有3'→5'外切酶活性,体内功能不清楚.

    ⑶pol Ⅲ:DNA链延长起主要作用,细菌中以1000dNTP/秒进行聚合反应.

    3'→5'外切酶活性,校对作用,与pol I配合使错误率降至10-6.如图所示

    DNA复制的保真性:遵守严格的碱基配对规律.-聚合酶对碱基的选择功能.聚合酶对错误碱基的校读作用.以上三种作用确保了DNA复制的准确性.

    2、真核生物DNA聚合酶

    特性与大肠杆菌相似,共五种:α、β、γ、δ、ε

    ⑴polδ:催化前导链及随从链的合成,需增殖细胞核抗原蛋白PCNA的参与.

    ⑵polα:与引发酶配合,参与随从链的合成.

    ⑶RFA(replication factor A):DNA延长中RFA与单链结合起到SSB的作用.

    三终止

    连接酶(ligase):使相邻的DNA片段,以3',5'磷酸二酯键相连,需ATP供能.