在RNA干扰实验中
首先需要构建dsRNA表达载体
将这种载体导入受体细胞中后
表达产生的dsRNA在DICER酶作用下形成siRNA
引起具有相同序列的mRNA发生讲解
导致细胞或个体不能合成相应的蛋白质
所以个体会表现出功能缺失表型
构建表达载体通常选用dsRNA
需要注意的一些方面是
dsRNA序列中GC的含量要小于50%
高GC含量会降低RNAi的效果
选定的dsRNA序列应通过搜索数据库确保与其他基因无同源性
以避免对其他同源性基因表达的抑制
不同区域的dsRNA具有不同的基因沉默效果
可同时构建两个以上针对同一基因不同靶区域的dsRNA表达载体
还要充分考虑siRNA的结构特征
siRNA与mRNA的同源程度对RNAi有明显影响
启动子区或者编码区与siRNA同源的基因受siRNA抑制
但siRNA在动物细胞中对mRNA的前体没有影响
所以含非编码区序列的dsRNA不会引起RNAi
而且在构建表达载体时
经常使用U6启动子等RNA聚合酶Ⅲ能够识别的启动子序列
最后将其转入到质粒中
这里说的只是一个简单的过程
总的来说构建表达载体是个比较复杂的过程
如果要知道详细的技术
建议还是去看书吧
这里是说不清的
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上面什么都有
正反义表达载体就是把目的基因正向或者反向插入到质粒中再转染
质粒中含有正向插入目的基因的就是正义表达载体
含有反向插入的就是反义表达载体