求PT-PCR操作流程

1个回答

  • 是RT-PCR啊.

    一、实验器具与材料:

    1、移液枪:1ml、200μl、20μl、10μl、2μl

    2、吸头:1ml、200μl、20μl

    3、匀浆管:5ml

    4、吸头台:放置1ml吸头的一个,放置20μl吸头的一个

    5、EP管:1.5ml、0.2ml、100μl

    6、试剂瓶:2个60ml的棕色试剂瓶(广口,带盖)

    1个125ml的白色试剂瓶(放无水乙醇)

    7、量筒:50ml、250ml、500ml

    8、容量瓶:250ml、500ml、1000ml

    9、试管架:5ml、1.5ml、20μl

    10、盐水瓶:250ml、500ml各2个备用,一个装无水乙醇,另一个装DEPC水

    11、铝制饭盒:4个

    12、塑料小饭盒:1个

    13、大瓷缸:2个

    14、锡泊纸:一卷

    15、卷纸:2卷

    16、三角烧瓶:带盖,稍大

    二、实验器具的处理与准备

    1、塑料制品:(包括枪头、EP管、匀浆管等)

    先将DEPC水从容量瓶中倒入瓷缸中,将塑料制品逐个浸泡其中,其中小枪头需要吸管打入DEPC水,过夜,然后高压,再烤干备用,实验前将枪头等放入吸头台,再高压一次(EP管)

    2、玻璃制品:泡酸过夜,冲洗干净,蒙锡纸烤干备用(DEPC水泡)(洗净后先泡1‰DEPC过夜,再烤干)

    3、匀浆器:(包括剪刀、镊子)先洗净后,再高压(不需要泡DEPC)

    三、试剂配制:

    1、DEPC水:吸出1ml放在1000ml双蒸水中配成1‰DEPC水,放在1000ml容量瓶中静置4小时备用.

    2、75%乙醇:用无水乙醇 DEPC水配,然后放-20℃保存(其中DEPC水需先高压)

    3、异丙醇:放入棕色瓶中

    4、氯仿:放入棕色瓶中

    5、琼脂糖

    四、几种缓冲液的配制:

    1、电泳缓冲液:

    Tris 54g

    硼酸 27.5g

    0.5M EDTA 20ml? pH8.0

    蒸溜水 1000ml

    5×TBE (贮存液)

    再将5×TBE稀释10倍成0.5TBE就可以在电泳时使用(即工作液浓度),如取50ml贮存液 450ml水--→500ml工作缓冲液

    2、上样缓冲液:

    0.25%溴酚蓝

    0.25%二甲苯青FF

    30%甘油

    6×缓冲液,4℃保存

    五、琼脂糖凝胶的配制:

    1、1.0%:

    1.0g琼脂糖 100ml电泳缓冲液,微波炉中火30秒至沸腾,熔化的琼脂物冷却至60℃时加入10mg/ml溴化乙锭2.5μl,充分混匀,将温热的凝胶倒入已置好梳子的胶膜中,在室温下放置30-45min后现进行电泳.

    2、1.5%:

    同上,将琼脂糖的量改为1.5g

    六、需购置的Rt-PCR材料:

    (生工. Tel. 2236106.)

    Taq酶(含MgCl2 Buffer) 200u 70.00

    dNTP: 1支

    oligo(dT)15: 1 OD 40.00 promega

    M-MLV: 1支 250.00 promega (Buffer)

    RNasin: 1支 110

    -- -20℃

    DEPC 5g 110.00

    Trizol 100ml/1瓶 Invitrogen Life technologies

    -- 4℃

    Marker: 10μg 0.2μg/ml 150.00 科威

    (1543. 994. 697. 515. 377. 231)

    七、引物合成

    正义:5′-CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC-3′

    反义:5′-TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT-3′

    2、par-4:

    正义:5′-GGGACCTCGGAACTCAAC-3′

    反义:5′-TGTATCTGCCTGGGACTG-3′

    3、退火温度计算

    2(A T) 4(G C)

    正反义平均数,再上下波动度(±4℃,或±5℃)

    4、引物各合成5 OD,每OD一瓶分装好

    5、引物稀释:

    加DEPC水量为(μl)

    = ? nmol / OD × 管上所标OD数×100

    是为10p mol / μl 浓度的引物溶液

    八、PCR产物电泳

    先将1-10μl左右PCR产物,加已点在纸上的溴酸兰,反复吸打混匀后进行电泳,一般电流为10mA,电源100V,电泳30分钟,紫外灯下观察,满意的结果扫描打印.

    九、几个注意点:

    1、逆转录的关键步骤是立即冰水浴?

    2、Rt时,先打开PCR预热30分钟.

    3、RNA抽提前,打开离心机预冷.

    TRIzol法抽提总RNA

    细胞1×107

    组织100mg

    加1mlTRIzol

    细胞用1ml加样器吹至液体澄清且无细胞团块

    匀浆(要彻底,后转至EP管)

    (组织匀浆量>100mg时分装1ml/每EP管)

    颠倒混匀10下,室温5分钟

    加氯仿1/5体积(0.2ml)(必须按总体积的1/5)

    颠倒混匀10下,室温5分钟

    4℃,离心12000g,15分钟

    转上层水相(约400μl)于另一1.5mlEP管中

    加等体积异丙醇(约400μl),混匀室温10分钟

    4℃,离心12000g,10分钟

    弃上清

    加冰预冷的75%乙醇(用DEPC水配)1ml

    4℃离心7500g,5分钟

    弃上清,空气干燥5-10分钟(不能完全干燥)

    溶于DEPC水中至20μl(10μl-20μl)

    (可在55-60℃水中,