培养细胞如何提取mRNA,如何逆转录?

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  • 1 细胞总RNA的提取

    1)、6孔板细胞(CNE-2)汇合度为90-100%时,取出无菌室,去其上清,用PBS洗两次后,每孔加TRIZOL试剂(Gibco公司) 1 ml,摇匀,无菌罩内消化3-5分钟(观察:液体变粘稠,细胞脱壁).

    2)、将各孔内消化好的细胞裂解液吸到一DEPC处理过的1.5 ml EP管中,加新开的氯仿0.2 ml,轻摇15秒.

    3)、室温静置2-3分钟后,12000 rpm,15 min,4℃,离心.然后取上清无色水相(约0.6 ml)到 EP管(DEPC处理过),加0.5 ml新开的异丙醇,室温下静置10分钟.

    4)、12000 rpm,10分钟,4℃,离心.观察总RNA在管底的白色沉淀,弃去上清(小心别丢了沉淀),75%乙醇1.0 ml洗涤(用DEPC水新配制)后,7500 rpm,5 min,4℃离心.

    5)、去上清,点离,用小Tip吸干液体.气干沉淀5-10分钟,DEPC处理水20-30 ul加入,中枪打匀,55-60℃水浴10分钟溶解总RNA,测OD值.

    6)、电泳.

    2 从总RNA中分离mRNA(Oligotex mRNA Mini Kit,Cat.no.:70022,QIAGEN)

    1)、取上述提取的总RNA若干(少于0.25 mg)到一个新的无RNase 的EP管中,用无RNase的水定容到250 ul.

    2)、加入Buffer OBB 250 ul,Oligotex Suspension 15 ul.用Tip打匀或用手弹匀.

    3)、70℃水浴,3分钟(裂解RNA的二级结构).

    4)、20-30℃条件下,静置10分钟(让Oligotex与mRNA结合).

    5)、高速离心2分钟,小心吸走上清(该上清要保留),留下约50 ul的上清在原管里.

    6)、用Buffer OW2 400 ul重悬含Oligotex/mRNA复合物的沉淀,然后将这些加到套有1.5 ml EP管的SPIN柱子上,高速离心1分钟.

    7)、将SPIN柱子移到一个新的EP管上,加Buffer OW2 400 ul到柱子,高速离心1分钟,丢掉滤过液.

    8)、将SPIN柱子移到一个新的EP管上,加20-100 ul热的(70℃)Buffer OEB到柱子上,用Tip来回吸打3-4次,高速离心1分钟.

    9)、为保证最大的 mRNA产量,可再次重复第8步.

    10)、电泳.

    RNA提取的原理就是核酸在异丙醇中的溶解度很低!其他步骤都是防止RNA降解和使RNA从细胞中溶出.

    逆转录过程请看参考资料.